接种环上的细菌数量不足，接种环过热。1、接种环上的细菌数量不足：平板划线法是一种分离纯化微生物的方法，需要在平板上划出一系列的平行线，使得细菌在划线处生长繁殖，形成单个的菌落。接种环上的细菌数量不足那么在划线到第三区时，细菌已经用尽无法继续划线。2、接种环过热：在平板划线过程中，接种环过热会导致细菌死亡，从而无法在平板上生长繁殖。因此在划线过程中，需要控制接种环的温度，避免过热。