使呼吸链的氧化与磷酸化偶联相互分离。二硝基苯酚标记探针的作用原理是使呼吸链的氧化与磷酸化偶联相互分离。破坏电子传递过程建立的跨内膜的质子电子梯度，使电化学梯度储存的能量以热能形式释放，ATP的生成受到抑制。